細(xì)胞傳代是細(xì)胞培養(yǎng)中最基本也是最常見的操作，傳代的意義是在于可以幫助我們擴(kuò)大細(xì)胞培養(yǎng)的總數(shù)，同時避免細(xì)胞在長滿培養(yǎng)瓶/皿后開始老化衰敗進(jìn)而死亡的情況。接下來會以“貼壁細(xì)胞”為例來進(jìn)行傳代操作詳解。

操作準(zhǔn)備

相較于細(xì)胞復(fù)蘇凍存，我們細(xì)胞傳代所需要做的準(zhǔn)備工作是最多的，好記性不如爛筆頭，我們需要在每一次實(shí)驗(yàn)前列好所需的實(shí)驗(yàn)器材、實(shí)驗(yàn)試劑。需要提前將無菌服、移液槍頭、廢液缸等實(shí)驗(yàn)器材進(jìn)行高溫高壓滅菌，并將所需的各類細(xì)胞的血清、培養(yǎng)基、胰酶溶液、雙抗以及支原體清除劑等確定用量后提前規(guī)整放置，保證可以一次性放入傳遞窗中，避免反復(fù)進(jìn)出細(xì)胞房造成污染。

用量確定方法：以單瓶細(xì)胞1:3傳代為例，每個T25培養(yǎng)瓶所需完全培養(yǎng)基6ml，終止消化反應(yīng)所需完全培養(yǎng)基6ml，所以總共需要配置24ml完全培養(yǎng)基。

當(dāng)我們做好以上準(zhǔn)備后，我們接下來就可以正式開始我們的傳代步驟了。

Operating Steps

操作步驟:

消洗后進(jìn)入準(zhǔn)備間，穿戴好滅菌服、滅菌手套以及口罩等防護(hù)用具進(jìn)入細(xì)胞房。

取出需要傳代的細(xì)胞后進(jìn)行觀察，彼此匯合率超過80%或細(xì)胞密度達(dá)到約8×10^5cells/ml左右時可以進(jìn)行傳代。

根據(jù)不同的細(xì)胞特性選取不同的血清、培養(yǎng)基進(jìn)行完全培養(yǎng)基配置完全培養(yǎng)基，普遍推薦比例為 1%P/S + 10%FBS + 基本培養(yǎng)基 （如擔(dān)心支原體污染可酌情加入1%支原體清除試劑）。

配置完成后從細(xì)胞培養(yǎng)箱中取出需要傳代的細(xì)胞瓶，消毒操作后用移液槍移去舊的培養(yǎng)液，加入1-2ml PBS緩沖液洗滌2次（加入PBS時需要從無細(xì)胞的一面加入，避免沖掉細(xì)胞）移除PBS緩沖液。

用移液槍加入2ml胰酶溶液（需在37%水浴鍋中預(yù)熱）輕微晃動使胰酶與細(xì)胞完全接觸后靜置在細(xì)胞培養(yǎng)箱中消化15-30s（具體胰酶含量以及消化時間需要視具體細(xì)胞情況而定）。

當(dāng)肉眼觀察細(xì)胞培養(yǎng)瓶中細(xì)胞層呈現(xiàn)磨砂狀且有細(xì)胞下流或在倒置顯微鏡下觀察細(xì)胞變圓潤且大量脫落時，準(zhǔn)備終止消化。

用移液槍加入等量完全培養(yǎng)基沖洗細(xì)胞終止消化，充分吹打細(xì)胞保證完全終止并且避免產(chǎn)生氣泡。

將細(xì)胞懸液轉(zhuǎn)移至離心管內(nèi)，設(shè)置1000r/min速率離心3min。

離心完成后將上清液倒去，加入新的完全培養(yǎng)基吹打混勻細(xì)胞（避免產(chǎn)生氣泡影響細(xì)胞活率）取樣觀察計算細(xì)胞數(shù)以及細(xì)胞活率，根據(jù)數(shù)據(jù)決定傳代比例。

同樣以1:3傳代為例，加入18ml完全培養(yǎng)基完全混勻后，在每個無菌T25培養(yǎng)瓶中移取6ml細(xì)胞懸液分裝，顯微鏡下觀察狀態(tài)后有序放置在37 、5%CO2細(xì)胞培養(yǎng)箱中培養(yǎng)。

至此傳代完成

細(xì)胞傳代小貼士TIPS ：

1、全程需嚴(yán)格無菌操作；

2、細(xì)胞較脆弱，吹打細(xì)胞過程需輕柔；

3、每次移液后需要更換槍頭，避免造成溶液交叉污染；

4、胰酶消化時間太久會加速細(xì)胞老化，需嚴(yán)格控制消化時間。